抗原修复法实验方案

使用福尔马林（甲醛液）固定會形式蛋白质的交联，并且可能掩盖组织标本中的抗原性位点，从而在检测某些蛋白质时，产生弱的或假阴性的免疫组化染色结果。目前有几种抗原修复常用的方法，而下面的实验方案，仅作为一般准则。

热诱导抗原决定表位修复法（HIER）

柠檬酸盐缓冲液（10 mM柠檬酸，0.05％聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯-20，pH 6.0）：

无水柠檬酸----------------------------------------------1.92克
蒸馏水-----------------------------------------------------1公升

混合溶解，并以1N NaOH调节酸碱度值至6.0，然后添加0.5毫升聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯-20並拌匀。

预热盛有染色皿的蒸锅或水浴锅，直到染色皿中之柠檬酸钠缓冲液（或柠檬酸盐缓冲液）的温度达到95-100摄氏度。然后将组织载玻片沉浸在染色皿中，把盖子松松地盖上并培育20-40分钟。最后取出染色皿到室温，并允许该染色皿继续冷却20分钟，才再进行免疫组化的染色步骤。

三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBS）（0.05 M TBS，0.05％聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯-20，pH值9.0）：

三羟甲基氨基甲烷------------------------------------ 6.1克
氯化钠---------------------------------------------------- 8.8克
蒸馏水---------------------------------------------------- 1公升

混合溶解，並用浓盐酸调节酸碱度值至9.0，然后添加0.5毫升聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯-20並拌匀。

预热盛有染色皿的蒸锅或水浴锅锅箱，直到染色皿中之三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水的温度达到95-100摄氏度。然后将组织载玻片沉浸在染色皿中，把盖子松松地盖上并培育20-40分钟。最后取出染色皿到室温，并允许该染色皿继续冷却20分钟，才再进行免疫组化的染色步骤。

EDTA缓冲液（1 mM的EDTA，0.05％聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯-20，pH 8.0）：

EDTA（Sigma公司，目录编号E-5134）------- 0.37克
蒸馏水----------------------------------------------------- 1公升

混合溶解，并以1N NaOH调节酸碱度值至8.0和，然后添加0.5毫升聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯-20並拌匀。此溶液可以在室温下存储3个月，或在4℃下贮存较长时间。

注意：此EDTA缓冲液能夠为许多抗体做出工优秀的结果，然而也往往产生较很高的背景（这可能与因这种预处理后，其内源性生物素显现有关）。所以此缓冲液常常需要第一抗体使用比较高稀释度，但它用于对低亲和力的抗体，或当组织抗原不是那么密集时，是非常有用的。

步骤：

1. 在二甲苯中去石蜡2次，每次5分钟。
2. 以100％乙醇进行2次水合作用，每次3分钟，然后以95％和80％乙醇各1分钟1次，最后用蒸馏水中清洗。
3. 预热盛有染色皿的蒸锅或水浴锅，直到染色皿中之三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水的温度达到95-100摄氏度。
4. 将组织载玻片沉浸在染色皿中，把盖子松松地盖上并培育20-40分钟（但最佳培育时间应该由用户来确定）。
5. 关掉蒸锅或水浴锅箱并取出染色皿到室温，让该染色皿冷却20分钟。
6. 以水冲洗组织载玻片2次，每次2分钟。
7. 用正常血清封闭缓冲溶液，封闭组织载玻片30分钟。
8. 必要时执行抗生物素蛋白阻断。
9. 先用抗体稀释缓冲液适当稀释第一抗体后，在室温培育组织切片1小时，或是在4摄氏度过夜培育。
10. . 用洗涤缓冲液冲洗组织载玻片2分钟，进行 2次。
11. 用过氧化物酶封闭缓冲溶液，封闭组织切片10分钟。
12. 用洗涤液冲洗2分钟，进行 3次。
13. 继续执行标准的染色实验步骤。
    
    请留意：微波炉或高压锅可以取代蒸锅或水浴锅，作为替代热源。
    

蛋白酶解诱导抗原蛋白修复法（PIER）

胰蛋白酶执行溶液（0.05％）：

胰蛋白酶原液（0.5％）------------------------------ 1毫升
氯化钙原液（1％）----------------------------------- 1毫升
蒸馏水 --------------------------------------------------- 1毫升

用1N NaOH溶液调节至pH 7.8。

用胰蛋白酶执行溶液覆盖组织切片，并在37摄氏度的潮湿箱內培育10-20分钟（最佳的培育时间，取决于组织的类型和固定的程度，并且应该由用户去认定）。培育后让组织载玻片在室温下冷却10分钟。

制作蛋白酶K执行溶液（1X，20微克/毫升）：

蛋白酶K原液（20X）------------------------------ 1毫升
Tris和EDTA缓冲液，pH8.0 ----------------------- 19毫升

拌匀。

用蛋白酶K执行溶液覆盖组织切片，并在37摄氏度的潮湿箱內培育10-20分钟（最佳的培育时间，取决于组织的类型和固定的程度，并且应该由用户去认定）。培育后让组织载玻片在室温下冷却10分钟。

冷冻组织切片的抗原蛋白修复法。

用磷酸缓冲盐溶液制作1％十二烷基硫酸钠溶液（SDS）：

十二烷基硫酸钠 ----------------------------------------- 1克
0.01 M的磷酸缓冲盐溶液（pH 7.4）------------- 100毫升

混合使之溶解。

以磷酸缓冲盐溶液冲洗组织切片载玻片3次，每次5分钟。用1％十二烷基硫酸钠溶液覆盖组织切片，并在室温下培育5分钟。之后再用磷酸缓冲盐溶液冲洗3次，每次5分钟（重要的是，要彻底地冲洗干净）。然后进行正常的染色実验步骤。

全部组织切片的同步蛋白修复法：

実验步骤：

1. 以4％多聚甲醛缓冲液固定组织，然后石蜡包埋的组织块，应该被切割成为适当的大小（例如切为3-5毫米厚的切片）。
2. 将组织切片沉浸在柠檬酸缓冲液中，并在4摄氏度过夜培育。
3. 在95-100摄氏度培育组织切片3-5分钟。
4. 立即将组织切片放入冷的30％蔗糖磷酸缓冲盐溶液中，在4摄氏度培育到該组织切片下沉。
5. 浸没处理的组织切片于石蜡包埋剂中，并用碎干冰迅速冻结。这时冷冻的组织切片就可以储存在摄氏-80度，和进行后面正常的実验过程。
   
   *以上方法仅供参考。研究者应该确定哪些実验方法最能满足自己的需求。请按照实验室安全程序进行。

[如有不明瞭处，請參阅英文Antigen Retrieval Protocol实验方案]